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植物内生菌次级代谢付加物研商揭穿一种新的环庚三烯酚酮生物合成机制

丛粒藻烷类化合物是富烃油藻—丛粒藻化学种B属的特征性生物标志化合物,其分子有机地球化学研究,对油页岩形成古生态过程的揭示,以及由此进行的古气候和古环境重建,以及页岩油气资源的评价和生物燃料油的研发具有重要意义。前人对茂名盆地油页岩中丛粒藻烷类生物标志物的结构报道存在质疑。近期,中国科学院广州地球化学研究所博士生廖晶和导师卢鸿利用气相制备色谱、核磁共振、高分辨质谱、红外光谱等仪器分析手段,对茂名盆地样品中该类化合物开展了分离、纯化和制备,发现一系列具有新型季碳β位甲基结构的新丛粒藻烷类化合物,并结合中间产物的结构信息对该类化合物的生物合成途径及其成因进行了合理的推断。主要进展如下:

植物内生菌(Endophyte)是指其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌。它们与植物的关系为互惠共生,其代谢产物可能能刺激植物生长发育,提高寄主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力,使得植物内生菌成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或生防载体菌的重要来源。同时植物内生菌也是目前天然药物活性分子发现的重要来源。

1)发现4个含季碳β位甲基结构的新丛粒藻类化合物,分别为2,3,6,7,10,12,15,16,19,20-十甲基-10-乙基-二十一烷(C33-新丛粒藻烷)、C33-丛粒藻烷-24-酮,2,3,6,7,10,12,15,16,19,20-十甲基二十一烷(两个非对映异构体,C31-丛粒藻烷):①新鉴定的C33丛粒藻烷-24-酮,羰基位置明显不同于前人报道的C33丛粒藻烯-10-酮;②将文献中鉴定的C33丛粒藻烷结构修订为具有与C33丛粒藻烷-24-酮一样新型碳骨架的C33-新丛粒藻烷,它们均存在新颖的季碳β位甲基结构;③将文献中鉴定为具有硅藻生源的两个C30-HBI化合物,修订为具有新丛粒藻烷骨架的两个C31-丛粒藻烷非对映异构体。上述新丛粒藻烷类化合物,与常规丛粒藻烷类化合物不同之处在于其核心含季碳β位甲基结构。该结构不仅在NMR数据中存在相关关系,而且可从Lindeman and Adam碳化学位移经验理论获得完美的验证。

中国科学院昆明植物研究所黄胜雄研究组以此为研究方向,对药用植物内生菌的次级代谢产物进行了系统性研究。在实验室成功构建了药用植物内生菌的分离鉴定、活性筛选、活性化合物提取以及生物合成的研究平台。从多种药用植物,如三七、重楼、龙血树和茶树等中分离了近2000株植物内生真菌和放线菌,从中发现了多个结构新颖的化合物,例如与云南大学微生物研究所赵立兴课题组合作从传统中药三七中分离得到内生真菌Penicillium manginii YIM PH30375,并从其发酵液中分离到一种新的聚酮来源的含7个环的联苯类二聚体化合物Duclauxamide A1。并通过晶体衍射和13C NMR DFT 计算确认了其绝对构型,纠正了duclauxins类化合物长期存在的C-9’R构型的错误。研究成果以New Duclauxamide from Penicillium manginii YIM PH30375 and Structure Revision of the Duclauxin Family 为题发表在Organic Letters(2015, 17 , 1146)。

2)提出了新丛粒藻烷类化合物的四元环生物合成途径:常规结构的C30-C37丛粒藻烯是通过两个C15法尼醇经三元环合成,依次甲基化作用后生成,茂名盆地中发现的4个新化合物结构中均存在新型季碳β位甲基结构,很难由传统的三元环合成理论形成;该研究提出了一条较为合理的、简捷的四元环合成路径:两个FPP经过c1′-2-3-2′连接形成四元环,经四元环开裂、反式prins反应直接生成C29丛粒藻烯,四次甲基化作用后即可生成新C33丛粒藻烯。传统的三元环合成路径要完成此结构转化,也必须先转变为四元环中间体,之后顺着四元环路径发展得到C33-新丛粒藻烯。类异戊二烯c1′-2-3-2′四元环的生物合成路径,显然与常规丛粒藻烷c2-1′-3的三元环合成路径不同,指示茂名盆地中发育的丛粒藻B属可能与现代B属丛粒藻不同;此四元环生物合成途径的基础理论意义可能对丛粒藻的基因工程培养具有指示作用。

最近通过对茶树(Camellia sinensis)中分离得到的内生放线菌Streptomyces sp. KIB-H033的代谢成分研究,分离得到了具有吡啶环、环戊酮环、环庚三烯酚酮环、呋喃环及吡喃环五环并构的新颖骨架的托酚酮类天然产物罗博卢酮A和B(rubrolone)。而其中的罗博卢酮 B具有一个稀有的苯甲酸-吡啶环内盐基团。通过ECD谱图的计算确认了该化合物轴手性。由于自然界含有托酚酮环的天然产物相对较少,而且其环形成的生物合成化学机制研究不够深入,仅有一篇关于真菌代谢托酚酮类化合物密挤青霉酸(stipitatic acid)生物合成的报道(PNAS, 2012, 109, 7042)的文献。通过13C-标记的醋酸盐的喂养实验初步研究了其生物合成碳原子的来源并推测罗博卢酮独特的环庚三烯酚酮环结构骨架苷元是由微生物二型聚酮合酶(type-II PKS)参与合成的,其间还经历了复杂的氧化重排过程。该发现与真菌中托酚酮类化合物密挤青霉酸(stipitatic acid)环庚三烯酚酮环的合成明显不同,代表着一个全新的环庚三烯酚酮环生物合成的化学机制。研究成果以Tropolone Ring Construction in the Biosynthesis of Rubrolone B, a Cationic Tropolone Alkaloid from Endophytic Streptomyces 为题发表在Organic Letters(2016, 18, 1254)。论文发表后,该研究还被综述杂志Natural Product ReportsNat. Prod. Rep., 2016, 33, 742)评选为热点研究化合物(Hot off the Press)。

3)提出了新丛粒藻烷类化合物的后生物形成途径:C33-新丛粒藻烯显然能够通过随后的光化学反应和成岩氢化作用生成新C33丛粒藻烷/烷酮。另外两个具有相同季碳β位甲基结构的非对映异构体C31丛粒藻烷显然也是来自于新C33丛粒藻烯:生物体死亡后,C33丛粒藻烯在水体中发生光化学反应,乙烯基断裂并氧化后生成C32丛粒藻烯酸,进入成岩还原环境后,C32丛粒藻烯酸发生脱羧和氢化作用,即可生成两个非对映异构体的C31丛粒藻烷。

以上研究得到国家自然科学基金项目(21372230, 81522044, 81302669)、云南省高端科技人才计划(2013HA022)和云南省应用基础研究计划(2015FB175)以及中组部青年千人计划等基金资助。

上述成果得到中科院战略重点研究项目(No. XDA14010102)、国家重点研发项目(No. 2017YFC0603102)、研究所135页岩气项目(No.135TP201602)和国家自然科学基金项目(No. 41673066, 41473045, 41673045和41773032)的资助,相关成果发表在国际刊物Organic Geochemistry上。

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论文信息:

图:罗博卢酮 B喂养实验及13C标记模式;已报道的真菌代谢天然产物密挤青霉酸中环庚三烯酚酮的生物合成机制;该研究推测的罗博卢酮中环庚三烯酚酮结构单元的生物合成机制。