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武汉病毒所在RNA病毒聚合酶中发现一种独特的保真度调控机制

RNA病毒包括多种人类和动物致病病原,对人类健康构成严重威胁。这类病毒的基因组复制过程不涉及DNA形式,因此需要由病毒自身编码的依赖RNA的RNA聚合酶来主导完成。病毒RdRP可准确而高效地实现多达数万个核苷酸的合成,并将合成的出错率水平维持在万分之一上下。在其他生命形式中,长链核酸的合成可存在纠错机制,从而使得核酸合成的总体出错率达到更低的水平,以维持物种对基因信息忠实传递的需求。然而,大多数RNA病毒的基因组复制过程缺少高效的纠错机制,因此RdRP的合成保真度成为RNA病毒变异和进化的关键因素。通过病毒与其宿主的共进化,病毒RdRP可实现对保真度水平的精确控制,过高的保真度将使得病毒缺少足够的基因突变储备以应对选择压力,过低的保真度则导致病毒基因信息难以稳定传续(Crotty, Cameron, Andino, PNAS 2001)。Raul Andino等人据此提出了基于基因组复制保真度调控的RNA病毒减毒疫苗研制策略(Vignuzzi, Wendt, Andino, Nat Med 2008),然而,病毒RdRP维持其最优保真度的机制仍不清晰,为相应的理性化疫苗设计和研制带来困难。

目前已知的RNA病毒的基因组长度均不超过35kb,编码容量非常有限。因此包含一个以上功能域的蛋白在这类病毒中较为常见,黄病毒科NS3蛋白即为丝氨酸蛋白酶和超家族二解旋酶的天然融合体,在病毒多聚蛋白酶解和基因组复制这两个重要过程中发挥关键作用,其两个功能域之间的协同作用机制尚不清晰。

流感病毒是危害全球公共卫生健康的重要病原之一,能在人群中引起大规模流行和季节性流感,每次暴发都会引起人类死亡并造成巨大的经济损失。流感病毒是分节段的负链 RNA 病毒,属于正粘病毒科,目前包括 A,B,C 和 D 四种类型。由于流感病毒易发生基因重配和抗原突变,现有疫苗无法提供持久性保护,再加上流感病毒的耐药性问题出现得越来越频繁,开发新型的抗病毒药物已然迫在眉睫。流感病毒聚合酶对于病毒复制增殖和宿主适应都具有重要作用,并且在不同类型流感病毒中较为保守,是抗病毒药物研发的重要靶点。因此对于流感病毒聚合酶工作机制的探索一直是研究热点。

中国科学院武汉病毒研究所研究员龚鹏课题组长期从事病毒RdRP的催化与调控机制研究,近期该团队解析了分辨率为2.1-2.5埃的猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)NS5B蛋白的系列晶体结构(代表性PDB号:5YF6),获得了NS5B分子中RdRP功能区与N端结构域(N-terminal domain, NTD)所形成的分子内相互作用的高分辨率三维结构信息。基于NTD-RdRP界面的细节,在关键位点设计了系列突变体来实现对界面的扰动。在所解析的五个NS5B点突变体晶体结构中,其中三个整体构象未发生变化,而另外两个结构中的NS5B则呈现出“开放式”构象(代表性PDB号:5YF8),不再保有NTD-RdRP分子内相互作用。通过一系列的体外RdRP酶学表征实验,进一步发现NTD-RdRP界面突变可明显降低RdRP的合成保真度,但同时并不影响RdRP链延伸阶段的复合物稳定性和反应性。CSFV隶属于黄病毒科瘟病毒属,同科不同属的代表性病毒还包括丙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、登革病毒等,但NTD在瘟病毒属外没有同源序列和同源结构,因此NTD作为一个融合结构域来调控RdRP的保真度是一种新颖而独特的机制。此项研究也为瘟病毒的减毒疫苗理性化设计提供了理论依据和理想的突变靶向位点。

中国科学院武汉病毒研究所研究员龚鹏课题组长期从事以聚合酶为核心的RNA病毒复制关键酶类的催化与调控机制研究,2013年10月起与武汉大学教授潘兹书课题组建立合作关系,共同研究黄病毒科瘟病毒属代表种猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)的NS5B聚合酶与NS3蛋白酶-解旋酶的功能机制。2015年和2017年,猪瘟病毒NS3解旋酶和全长晶体结构先后报道,但结构中并未发现蛋白酶与解旋酶形成的分子内关键相互作用。近期,该合作团队解析了一种新的“关闭式”构象的NS3全长晶体结构(PDB号:5WX1),结构中蛋白酶与解旋酶形成了由三个相互作用簇构成的面积达2200平方埃的分子内作用界面,首次发现了瘟病毒NS3可采取一种和蛋白酶顺式切割相关的构象,明确与反式切割不兼容。团队对此关闭式构象的生物学相关性进行了体外酶学验证,发现这一构象具有最优的解旋酶活性,通过点突变扰动该构象可导致解旋酶活性大幅降低。进一步通过在全长病毒水平的测试发现对上述三个相互作用簇的扰动均可不同程度地影响病毒滴度和病毒噬斑形成及尺寸,验证了晶体结构所揭示的关闭式构象对病毒复制的重要性。

流感病毒聚合酶由 PA、PB1 和 PB2 三个亚基组成,并以核糖核酸蛋白复合物形式来行使病毒基因组复制和转录双功能。病毒基因组复制过程可以分为两步:第一步通过结合保守的病毒 RNA启动子从末端起始从头合成互补 RNA;第二步通过结合保守的 cRNA 启动子,从内部起始从头合成病毒基因组 RNA 产物。病毒基因组转录过程则依赖宿主细胞的 RNA PolII 复合物,通过掠夺并利用宿主来源的加帽 RNA作为引物合成转录产物,从而启动后续病毒蛋白的表达。病毒聚合酶合成 RNA 过程又可以进一步分为起始、延伸和终止三个阶段。

此项研究使用的CSFV相关基因材料由武汉大学教授潘兹书提供,此项研究受到国家重点研发计划项目“畜禽重要病原共感染与协同致病机制研究”(2018YFD0500100,项目首席科学家为中国农业科学院上海兽医研究所研究员丁铲)和国家自然科学基金面上项目“猪瘟病毒NS5B蛋白N端结构域的功能研究”(31670154,项目主持人为龚鹏)的支持。博士研究生刘伟驰为论文第一作者,硕士毕业生石晓玲为共同作者,相关论文近期在Nucleic Acids Research上在线发表。

黄病毒科NS3不仅自身具有功能多样性,还直接参与调控病毒聚合酶的功能,研究成果不仅为全面阐释NS3的功能提供了重要依据,也为进一步研究NS3与NS5B聚合酶的分子间调控机制奠定了基础。此项合作研究受到科技部973项目“重要病毒转录复制蛋白复合体的结构功能研究”和数项国家自然科学基金面上项目的支持。潘兹书课题组的博士研究生郑峰伟和龚鹏课题组的助理研究员逯国亮为论文的并列第一作者。

过去五年里,前人通过晶体学技术成功解析了 A,B 和 C 型流感病毒聚合酶的结构,并对它们的复制和转录功能机制有了初步认识,但是关于 D 型流感病毒聚合酶的研究鲜有报道。同时流感病毒基因组的复制和转录过程是一个极为复杂的过程,除了聚合酶本身,还需要病毒 RNA、其他病毒蛋白以及宿主因子的共同参与,才能高效准确地完成这个过程。目前对于这个复杂过程的认知尚有许多空白,亟需研究人员去填补。